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标题: 求助光学测量方面的问题(急)(1) [打印本页]

作者: nemy 时间: 2009-4-16 08:35
标题: 求助光学测量方面的问题(急)(1)
请各位大峡帮忙,以下光学仪器的工作原理:
1:测角仪
2:球径仪
3:分光光度计
4:激光平面干涉仪

作者: fishnapper 时间: 2009-4-16 10:51
1，没用过，但是有光学基础想必看懂原理不难，参考书籍《光学测量》或其说明书
2，没用过，但是其光路原理很好懂，可参阅《光学手册》或其说明书
3，这个名字涉及的领域太广，工作原理大概知道，但是因具体仪器不同会有差异，王之江老师那本光学手册里有讲解，或者光度学、色度学的资料都会提到
4，very熟悉，也有很多资料可以查询……太多了，几乎每本光学测量资料都会提到干涉仪原理的
问题的关键是，你到底需要什么程度的工作原理介绍？从哪个方面去阐述？

作者: noodlesy 时间: 2009-4-16 11:10
1# nemy

search on the web

作者: SHPL 时间: 2009-4-16 13:00
楼上说的对！！

作者: linyj20 时间: 2009-5-13 15:32
本帖最后由 linyj20 于 2009-5-13 15:34 编辑

测角仪：平行光管反射法（非接触式）

作者: linyj20 时间: 2009-5-13 15:34
球径仪：通过矢高和测量口径换算出R度（接触式）

作者: linyj20 时间: 2009-5-13 15:35
分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。
　　而分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。常用的波长范围为：(1)200～400nm的紫外光区,(2)400～760nm的可见光区,(3)2.5～25μm（按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>）的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式： 1 A=log ─ =ECL T 式中 A 为吸收度； T 为透光率； E 为吸收系数，采用的表示方法是(E1％ 1cm),即吸收度换算成溶液浓度为1％(g/ml)，液层厚度为1cm的数值； C 为100ml溶液中所含被测物质的重量，g(按干燥品或无水物计算）； L 为液层厚度，cm。物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后,可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收,但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。
　　分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
　　分光光度计的简单原理
　　分光光度计计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
　　核酸的定量
　　核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
　　事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
　　除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。
　　蛋白质的直接定量（UV法）
　　这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
　　比色法蛋白质定量
　　蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。
　　比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。
　　Lowry 法：以最早期的Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2 反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。
　　BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
　　Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定１小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
　　某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller等测试人奶中的蛋白，结果Lowry，BCA 测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以BSA作标准品，浓度1.34mg/ml，以a球蛋白作标准品，浓度2.64mg/ml。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后1011分光光度计的重要配件—— 比色杯的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。
　　细菌细胞密度（OD 600）
　　实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。
　　分光光度计的重要配件—— 比色杯
　　比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。
　　由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette®塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。
　　随着科技的发展，现在比色杯已经不是使用分光光度计时的必备物品。目前国外Nanodrop公司（现已被Thermo Fisher公司收购）生产的ND1000分光光度计与旧式分光光度计相比，已经可以做到无需稀释样品，无需使用比色杯，每次测量仅需1-2μl样品即可完成测量。

作者: linyj20 时间: 2009-5-13 15:37
激光平面干涉仪：以激光波长为已知长度利用迈克耳逊干涉系统测量位移的通用长度测量.工具激光干涉仪有单频的和双频的两种。
　　激光具有高强度、高度方向性、空间同调性、窄带宽和高度单色性等优点。目前常用来测量长度的干涉仪，主要是以迈克尔逊干涉仪为主，并以稳频氦氖激光为光源，构成一个具有干涉作用的测量系统。激光干涉仪可配合各种折射镜、反射镜等来作线性位置、速度、角度、真平度、真直度、平行度和垂直度等测量工作，并可作为精密工具机或测量仪器的校正工作。
　　单频激光干涉仪
　　从激光器发出的光束，经扩束准直后由分光镜分为两路，并分别从固定反射镜和可动反射镜反射回来会合在分光镜上而产生干涉条纹。当可动反射镜移动时，干涉条纹的光强变化由接受器中的光电转换元件和电子线路等转换为电脉冲信号，经整形、放大后输入可逆计数器计算出总脉冲数，再由电子计算机按计算式[356-11]式中λ为激光波长(N 为电脉冲总数)，算出可动反射镜的位移量L。使用单频激光干涉仪时，要求周围大气处于稳定状态，各种空气湍流都会引起直流电平变化而影响测量结果。
　　双频激光干涉仪
　　在氦氖激光器上，加上一个约0.03特斯拉的轴向磁场。由于塞曼分裂效应和频率牵引效应, 激光器产生1和2两个不同频率的左旋和右旋圆偏振光。经1/4波片后成为两个互相垂直的线偏振光,再经分光镜分为两路。一路经偏振片1后成为含有频率为f1-f2的参考光束。另一路经偏振分光镜后又分为两路：一路成为仅含有f1的光束,另一路成为仅含有f2的光束。当可动反射镜移动时,含有f2的光束经可动反射镜反射后成为含有f2 ±Δf的光束，Δf是可动反射镜移动时因多普勒效应产生的附加频率,正负号表示移动方向(多普勒效应是奥地利人C.J.多普勒提出的，即波的频率在波源或接受器运动时会产生变化)。这路光束和由固定反射镜反射回来仅含有f1的光的光束经偏振片2后会合成为f1-(f2±Δf）的测量光束。测量光束和上述参考光束经各自的光电转换元件、放大器、整形器后进入减法器相减,输出成为仅含有±Δf的电脉冲信号。经可逆计数器计数后，由电子计算机进行当量换算（乘 1/2激光波长）后即可得出可动反射镜的位移量。双频激光干涉仪是应用频率变化来测量位移的，这种位移信息载于f1和f2的频差上，对由光强变化引起的直流电平变化不敏感，所以抗干扰能力强。它常用于检定测长机、三坐标测量机、光刻机和加工中心等的坐标精度，也可用作测长机、高精度三坐标测量机等的测量系统。利用相应附件，还可进行高精度直线度测量、平面度测量和小角度测量。

作者: nemy 时间: 2009-5-14 08:33
专家.......................................

作者: wjf990 时间: 2009-5-14 12:23
本帖最后由 wjf990 于 2009-5-14 14:59 编辑

1.测角仪-分精密测角仪和比较测角仪，精密测角仪主要用作绝对测量，比较测角仪是通过观察被测角度的表面反射像与角度基准块表面反射像的差值来推算被测角的实际值。在相关光学工具书上可以找到有关的光路介绍。
   2.球径仪分机械球径仪和光学球径仪，机械球径仪以已知直径测量环或在已知直径上分布的三钢球为基准平面，使用平晶对零后放待测零件测得矢高值，再通过公式计算R值，适用范围较广，精度中等；光学球径仪一般只用于对光学元件表面R值进行精密测量，在带有读数装置的光具座上分别找到零件被测表面的顶点反射像和球心像，其间的距离读数就是盖表面的R值。
   3.激光干涉仪是利用光的干涉原理，通过观察被测零件表面和基准表面之间的干涉情况来判断被测零件表面的面形好坏，平面和球面干涉仪的不同只在于使用的参考表面是平面还是球面，另外要注意球面干涉仪是由多块参考镜头的，要根据测量范围的不同来选择不同的参考镜头，激光干涉仪根据原理可分为拉曼干涉仪、斐索干涉仪等，原理光路参见光学测量方面工具书。
   4.至于分光光度计，我对分光光度计的了解也不是很多，楼上老兄拉来的资料够详细了，在此不再多言。

作者: nancy-y 时间: 2009-5-25 16:55
推荐浏览欧唐技术博客：http://opturn.blog.sohu.com
有很多干涉仪等仪器的原理文章，而且都是目前检测加工方面最先进的技术。

作者: chenws1987 时间: 2009-6-27 14:51
路过看看学习了！！！

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